Chromatographie: Bedeutendes Verfahren zur Stofftrennung

Der Begriff der Chromatographie bezeichnet verschiedene Verfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen in ihre einzelnen Komponenten. Die in der Chemie und Biologie weit verbreiteten Verfahren machen sich die spezifischen Eigenschaften der enthaltenen Moleküle zunutze. Das Grundprinzip der Chromatographie basiert dabei auf den unterschiedlich ausgeprägten Wechselwirkungen zwischen den Bestandteilen der Substanz mit einer mobilen und einer stationären Phase.

Heute spielen die Verfahren zur Stofftrennung eine wichtige Rolle in vielen Bereichen der Chemie und der Biologie. In analytischen Anwendungsbereichen nutzen Fachleute das Verfahren, um die Zusammensetzung von Stoffgemischen zu untersuchen. Damit sichern sie eine stabile Erzeugnisqualität oder prüfen die Wirksamkeit von Reinigungsverfahren. Als präparative Chromatographie dienen die Verfahren auch direkt der Produktion. Hier liegt der Schwerpunkt auf der Reinigung und Isolierung von Substanzen.

Die Verfahren im Überblick

Die Verfahren der Chromatographie nutzen verschiedene Effekte, um die unterschiedlichen Bestandteile einer Substanz abzutrennen, darunter:

• Adsorption
• Verteilung
• Siebwirkung
• Ionenaustausch
• Affinität
• Chiralität

Der Prozess basiert auf dem Einsatz einer stationären Phase und einer mobilen Phase. Diese fließt zusammen mit der darin gelösten zu trennenden Substanz durch die stationäre Phase. Je weniger die Komponenten der Probe an der stationären Phase haften, desto weiter oder schneller transportiert sie die mobile Phase. Das Ergebnis ist die gewünschte zeitliche oder räumliche Trennung der einzelnen Bestandteile. Der Prozess lässt sich wie folgt gliedern:

1. Fluss der mobilen Phase herstellen
2. Zu trennende Probe injizieren (Injektion)
3. Mobile Phase und zu trennende Stoffe durch die stationäre Phase laufen lassen (Trennung)
4. Sichtbar machen, wo Substanzen zu liegen kommen oder wann sie einen bestimmen Teil des Systems passieren (Detektion)

Die zu trennenden Substanzen, der Anwendungszweck und die Anforderungen an die Genauigkeit der Ergebnisse geben den Ausschlag für das optimale Chromatographie-Verfahren. Die wichtigsten Varianten im Überblick:

Verfahren	Mobile Phase	Stationäre Phase	Typische Anwendung
Papierchromatographie (PC)	Flüssigkeit	Papier als feste Phase, Orientierung abhängig von Entwicklungsart	Preiswerte Kontrolle von Synthesereaktionen und Homogenitätsüberprüfung von Zwischen- und Endprodukten
Dünnschicht- chromatographie (DC)	Flüssigkeit	Feste Phase als feine Schicht auf Trägerfolie oder Glasplatte	Kontrolle von Synthesereaktionen bei Anwendungen mit hohen Anforderungen an Analysegeschwindigkeit und Nachweisempfindlichkeit
Säulenchromatographie (SC)	Flüssigkeit	Festes Trägermaterial als Säulenpackung	Präparative Trennung größerer Stoffmengen
Ionenaustausch- chromatographie (IC)	Flüssigkeit	Fester Ionenaustauscher als Säulenpackung	Routinemäßige Analytik wässriger Systeme, vor allem von Trinkwasser
Gaschromatographie (GC)	Gas	Flüssige oder feste Phase in spiralförmiger Röhre	Präzise Analyse komplexer Stoffgemische, die gasförmig oder verdampfbar sind

Vor allem die Hochleistungschromatographie (HPLC) hat eine ausgeprägte Praxisrelevanz für die Analytik. Bei dieser Variante sorgen besonders hohe Drücke dafür, dass die mobile Phase die Säule mit gesteigerten Flussraten passiert. Für die Polymeranalyse interessant ist das Teilgebiet der Größenausschlusschromatographie (SEC) oder Gelpermeationschromatographie (GPC). Hier dient das hydrodynamische Verhalten als Trennmechanismus, sodass die Moleküle nach ihrer Größe geordnet werden.

 

Papierchromatographie

Das papierbasierte Verfahren ist mit besonders einfachen Mitteln durchzuführen. Als stationäre Phase dient ein Papier mit definierten Eigenschaften hinsichtlich Reinheit, Qualität und Konsistenz. Bei der aufsteigenden Variante steht es senkrecht in einem Glasbehälter und saugt durch die Kapillarwirkung die mobile Phase von unten nach oben. Dabei handelt es sich um organische Lösungsmittel oder Gemische (Laufmittel). Die zu trennende Substanz bringt der Techniker oberhalb der Oberfläche der mobilen Phase auf. Das Ergebnis (Chromatogramm) sind Substanzflecken auf dem Papier, die Aufschluss über die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten geben.

Die Papierchromatographie eignet sich für kleine Substanzmengen im Bereich zwischen 5 bis 50 Mikrogramm. In Abhängigkeit von der Fließrichtung des Laufmittels lassen sich noch die absteigende und die Rundfilter- oder Zirkularmethode als weitere Varianten nennen.

Dünnschichtchromatographie

Auch hier erhält der Techniker ein flächiges Chromatogramm als Ergebnis. Statt des Papiers kommt jedoch fein pulverisiertes Material wie Cellulose, Kieselgel oder Aluminiumoxid zum Einsatz. Als Trägermaterial dienen dünne Folien aus Aluminium oder Kunststoff. Bei uns finden Sie eine große Auswahl von DC-Platten als stationäre Phase.

Je nach Anwendung können Zugaben wie Ammoniak-Lösung oder Natriumcitrat für ein homogenes Fließbild erforderlich sein. Als mobile Phase dient häufig ein Alkohol-Wasser-Gemisch. Für den präparativen Einsatz eignet sich die zirkuläre Verfahrensvariante besonders gut. Dabei kommt eine beschichtete Kreisscheibe zum Einsatz, die kontinuierlich rotiert.

 

Säulenchromatographie

Namensgebend für dieses Verfahren der Chromatographie ist der langgezogene Behälter. Gefüllt mit einem Trägermaterial als stationäre Phase, wird er vom Laufmittel und den darin gelösten Stoffen von einem Ende zum anderen (beispielsweise von oben nach unten) durchströmt. Die Stoffe mit der höchsten Fließgeschwindigkeit treten als Eluat unten aus der Säule aus. So eignet sich das Verfahren besonders für die Stofftrennung bei großen Einsatzmengen.

 

Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie nutzt ebenfalls gepackte Säulen. Als Trägermaterial für die mobile Phase dienen hier sogenannte Ionenaustauscher, also Stoffe, die Anionen oder Kationen an sich binden können. Im Gegenzug geben sie andere Moleküle ab. Der typische Bereich für das Injektionsvolumen liegt zwischen 10 und 100 Mikroliter. Eine gängige Anwendung stellt das Abtrennen von Schwermetall-Ionen aus Wasser dar.

 

Gaschromatographie

Die Anwendung der Gaschromatographie ist beschränkt auf Stoffe, die gasförmig oder verdampfbar sind. Als mobile Phase dient ein Inertgas, beispielsweise Helium, Argon oder Stickstoff. An die Stelle der Säule tritt ein spiralförmiges Rohr mit einem Durchmesser von wenigen Millimetern. Im Inneren befindet sich die stationäre Phase, häufig basierend auf Kieselgel oder Silikonöl als Trägermaterial. Erst wenn das Gas bereits durch die Trennsäule strömt, injiziert der Techniker das Stoffgemisch. Autosampler gestalten die Abarbeitung vieler Proben besonders rational.

Die einzelnen Bestandteile passieren die stationäre Phase mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Verantwortlich dafür ist das spezifische Verhalten hinsichtlich Lösung oder Adsorption. Das Chromatogramm erzeugt ein Wärmeleitfähigkeitsdetektor, der die Temperatur überwacht. Grundlage für die Auswertung ist ein Signal-Zeit-Diagramm. Es weist jeweils dann einen Peak auf, wenn eine der aufgetrennten Komponenten das System verlässt.

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie erfordert die Verwendung einer für den Analyten spezifischen Verbindung als stationäre Phase. Sie bewirkt die Trennung, indem sie einen geeigneten Ligand für das abzutrennende Molekül darstellt. Das Verfahren zählt gleichzeitig zu den teuersten und leistungsfähigsten Methoden der Stofftrennung. Haupteinsatzfelder sind die Aufreinigung von Nukleinsäuren, Blut und Proteinen.

Trennsäulen für die Adsorptionschromatographie

Säulen-, Papier- und Dünnschichtverfahren nutzen das Trennprinzip der Adsorption. Für die Trennung des Substanzgemisches in den Säulen stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: Normale Phase und Umkehrphase (Reversed Phase). Im ersten Fall ist die stationäre Phase polar, wobei die mobile Phase keine oder zumindest eine deutlich geringere Polarität aufweist. Bei der Reversed Phase ist es genau umgekehrt. Je nach verwendeter Packung in der Trennsäule werden entweder lipophile oder polare Stoffe leichter herausgelöst.

Die Entwicklung innovativer Säulenpackungen bringt Fortschritte bei der Dauer der Analyse unter hohen Drücken. Neue Core-Shell-Phasen treten zunehmend an die Stelle der porösen Kügelchen als klassische HPLC-Phase. Sie verkürzen die Diffusionswege der mobilen Phase und ermöglichen so eine viel höhere Trennleistung. Das Ergebnis sind kleinere Trennstufenhöhen bei hohen Fließgeschwindigkeiten. Das zahlt sich zum Beispiel bei der Trennung von Peptiden besonders aus.

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